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曲形脱溶剂装置(CDL)温度200 ℃

更新时间:2019-10-29 09:56点击:

  地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L. 干燥根,归肝、大肠经,具有凉血止血、解毒敛疮之功;临床常用于便血、崩漏、水火烫伤、痈肿疮毒[1];具有凉血止血、抗氧化、抗感染、免疫调节[2]、肾保护[3]、修护受损皮肤和敛疮减渗[4]等作用。其主要成分为三萜、酚类和黄酮类化合物。以单味地榆制备的中成药地榆升白片,临床上对骨髓造血系统的保护和增强具有良好的效果,能有效预防化疗药物对造血系统的破坏[5]。地榆在中医临床上常伍用,以水煎服,炒炭为常用止血药。而生地榆能降低毛细血管的通透性,减少渗出、感染,减轻组织水肿。生地榆水煎液抗炎作用强于地榆炭水煎液[6],并且研究发现地榆水煎液对癌细胞的生长具有抑制作用[7]。目前尚未有研究全面系统地阐述地榆水煎液的化学成分群的组成。本研究基于具高灵敏度、高分辨率和多级质谱功能的高效液相串联离子阱-飞行时间质谱(HPLC-IT-TOF/MS),对地榆水煎液的化学成分群进行系统解析,共鉴定了82个主要化学成分并进行分类,进一步明确了地榆的药效物质基础。

  3.1.3 儿茶素类 儿茶素作为鞣质的前体,在本研究中,由其m/z 289.0665 [M——H]?,MS2碎片离子m/z 245、231、205、203、187、179、161,可鉴定化合物27和39为儿茶素类。通过高斯软件,可以预测儿茶素的偶极矩为3.98 D(Debye),表儿茶素的偶极矩0.58 D,因此可以判断化合物27是儿茶素,化合物39是表儿茶素,判断的结果与对照品比对的结果一致。地榆水煎液中存在着较多的儿茶素多聚体及儿茶素与没食子酸聚合物,儿茶素的裂解规律如图4所示,以没食子酸和儿茶素的裂解规律为依据,初步鉴定出没食子儿茶素(3.14 D)、表没食子儿茶素(1.37 D)、原花青素B-3(儿茶素二聚体)、原花青素C2(儿茶素三聚体)、非瑟酮醇- (4β-8)-儿茶素(6.35 D)、非瑟酮醇-(4α-8)-儿茶素(4.16 D),3-O-没食子酰基-原花青素B3(儿茶素二聚体单没食子酸酯)、儿茶素没食子酸酯以及表儿茶素-(4→8)-没食子儿茶素,部分相关结构及其裂解规律如图4所示,具体信息见表1。

  通过查阅国内外文献以及相关的数据库,建立地榆169个化学成分的本地数据库。根据化合物高分辨的相对分子质量、二级质谱碎片信息及在线数据库的检索(上海有机化学研究所化学专业数据库、Chemspider、XCMS等),共鉴定了82个成分(含同分异构体),包括69个酚类成分、8个三萜类成分及3个黄酮类成分、1个有机酸和1个单萜烯醇苷(图1和表1),峰号按保留时间排序。其中的柠檬酸、短叶苏木酚酸、甲氧基没食子酸甲酯-硫酸酯、异鼠李素-硫酸酯、鞣花酸甲氧基衍生物-硫酸酯等物质在地榆中首次发现。由于化学成分群中出现大量的同分异构体,本研究采用Gauss软件,计算已知异构体3D结构的偶极矩,比较其极性的大小,从而对部分同分异构体准确指认。以下对各类化合物进行结构特征解析。

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  在地榆水煎液中,没食子酸与糖类形成苷类是典型的特征成分。葡萄糖的羟基可以与没食子酸的羧基形成酯键,或者与酚羟基形成醚键。没食子酸与糖类形成的可水解鞣质是较典型的特征性成分,其裂解规律为中性丢失葡萄糖基(m/z 162)或中性丢失没食子酰基(m/z 152)。

  采用电喷雾电离离子源(ESI),正负离子分别检测,扫描范围m/z 100——1 200,以三氟醋酸钠作为校正液,检测电压1.60 kV,雾化气体积流量1.5 L/min,曲形脱溶剂装置(CDL)温度200 ℃,离子累积时间30 ms,毛细管电压?3.5 kV(负离子)、4.5 kV(正离子),诱导碰撞解离(CID)能量50%。柱后分流,分流比为1∶3。

  生地榆(产地辽宁,批号1609021)由天士力现代中药资源有限公司提供,经中国药科大学张勉教授鉴定为地榆Sanguisorba officinalis L.。儿茶素(批号)、没食子酸(批号110831- 200803)、金丝桃苷(批号11),均购自中国食品药品检定研究院;乙腈(质谱纯,Merck公司);甲酸(色谱纯,上海阿拉丁试剂公司)。

  根据碎片信息结合文献调研(表1),本研究还鉴定了3个黄酮类化合物、1个有机酸和1个单萜烯醇苷,具体为槲皮素-3-阿拉伯糖苷、异鼠李素-硫酸酯、金丝桃苷、柠檬酸、香叶醇-1-O-呋喃阿拉伯糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。其中对金丝桃苷进行了对照品确认。

  取生地榆饮片20 g,分别加8倍和6倍量的水回流提取2次,每次1 h,滤过,合并滤液,得地榆水煎液。精密移取5 mL水煎液,加甲醇稀释定容于10 mL的量瓶,混匀后,取适量混合液,于12 000 r/min离心10 min,取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过,即得。

  3.1.1 没食子酸鞣质类 在二级质谱的特征中,发现地榆酚类成分主要是没食子酸的衍生物。通过对照品比对,发现没食子酸只在负离子模式下响应,其分子离子m/z 169.016 6 [M——H]?,碎片离子125.030 1 [M——H——CO2]?。化合物31和37,由分子离子m/z291.016 6 [M——H]? 得到分子式C13H8O8,根据碎片离子信息247.037 0 [M——H——CO2]?、203.052 0 [M——H——2CO2]?,紫外吸收波长为284和347 nm(50%甲醇),推断这2个化合物为短叶苏木酚酸(化合物37)及其异构体(化合物31),并且其裂解规律和光谱信息与文献报道一致[32]。另外本研究还发现几个特征性的硫酸酯化酚类。化合物50,其分子离子峰为m/z 277.000 0 [M——H]?,碎片离子有197.046 1 [M——H——SO3]?、182.014 9 [M——H——SO3——CH3]?、166.999 8 [M——H——SO3——2CH3]?,结合文献初步鉴定该化合物为甲氧基苯甲酸甲酯- 5-O-硫酸酯[18],并且根据裂解规律,初步推断化合物36和64为该化合物的类似物,分别为葡萄糖基丁香酸和3,4-二甲氧基苯甲酸甲酯-5-O-硫酸酯。

  本研究系统地分析了地榆水煎液的成分群,进一步明确了地榆水煎液的物质基础。以期为地榆的药效和代谢研究提供更充实的物质基础和方法参考。从正负总离子流图的化合物分析可知,地榆水煎液的主要成分为鞣质,结构类型以没食子酸或儿茶素为前体的缩合鞣质。现代研究表明地榆水提液对人白血病细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞的生长具有抑制作用[7]。地榆鞣质对化学物质所致的骨髓抑制以及白细胞减少症具有明显的治疗作用[5,35],能抑制HK-2细胞的增殖,防止肾间质纤维化[36],并且还具有抗脂质过氧化活性。

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  (1)一没食子酸糖苷:方中水煎液的一没食子酸糖苷及其成分有6个,质谱给出准分子离子m/z 331.066 1[M——H]?,中性丢失m/z 162,可以推断该类化合物糖基化(葡萄糖或金缕梅糖),结合碎片离子m/z 169.047 5及其裂解规律,故初步推断化合物1、2、4——6、8均为一没食子酸糖苷。化合物11、14,其m/z 345.080 4[M——H]?,丢失一分子甲基葡萄糖(m/z 176),得到没食子酸离子169.016 6和碎片离子125.019 4,从而推测该2个化合物为一没食子酰基-甲基葡萄糖苷[11]。

  (2)二没食子酸糖苷:提取离子流图中发现有10个m/z 483.073 5 [M——H]?的分子离子峰,并且具有特征碎片离子m/z 331.075 7 [M——H——Gal]?、313.054 8 [M——H——Gal——H2O]?、169.016 6 [M——H——Gal——Glu]? [11],由于文献报道[33],地榆中含有二没食子酰葡萄糖苷、1,2′-O-二没食子酰基-金缕梅糖、金缕梅鞣质,所以与没食子酸酯化的糖基可能为金缕梅糖或葡萄糖,而没食子酸上的酚羟基也可与葡萄糖上的羟基缩合,从而形成没食子酸-O-(6′-O-没食子酰基) 葡萄糖苷[11],因此该10个化合物初步推断为二没食子酰葡萄糖苷或异构体。对于化合物32、35、45,其母离子m/z 497.096 0 [M——H]?,根据碎片离子m/z345.085 1 [M——H——Gal]?、327.065 5 [M——H——Gal——H2O]?、169.047 5 [M——H——Gal——methylglucose]?,从而初步鉴定这3个化合物为4,6-O-二没食子酰基-甲基葡萄糖苷及其异构体[11]。

  HPLC-ESI-IT-TOF/MS(日本岛津公司,包括自动进样器、二元梯度泵、柱温箱、PDA检测器);Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司),超声波清洗器(KQ-500DV,昆山市超声仪器有限公司);高速冷冻离心机(ST16R,美国Thermo Fisher Scientific)。

  总结国内外大量的相关文献,发现本研究鉴定的柠檬酸、短叶苏木酚酸、金丝桃苷、硫酸酯类为地榆中首次发现。已知硫酸化代谢物广泛分布于海洋生物[37],有研究发现[38-40],中药材硫磺熏蒸和体内II相代谢也会导致部分成分发生硫酸酯化。为了探明硫酸酯化成分产生的原因,笔者又分析了新鲜采挖地榆的化学成分,发现新鲜地榆也含有甲氧基没食子酸甲酯-5-O-硫酸酯和3,4-O-二甲基没食子酸甲酯-5-O-硫酸酯,提示硫酸酯类成分可能为地榆的特征次生代谢产物。硫酸酯化能提高化合物的水溶性、改变活性,此类化合物的药效作用和植物代谢产生途径有进一步研究的价值。

  文献报道地榆含有一系列地榆素类化合物[14],该类化合物结构以没食子酸多聚体与糖类聚合。根据母离子m/z 633.071 4 [M——H]?,结合碎片离子m/z481.0535 [M——H——Gal——H2O]?、300.999 5 [M——Gal——Glu——2H2O]?,推断出该类化合物具有3分子没食子酸聚合1分子葡萄糖的骨架,文献报道,地榆均含有sanguiin H4和sanguiin H5[34],这2个化合物互为顺反异构体,故鉴定化合物17、20、30为sanguiin H4或其异构体。根据以上述裂解特征,结合分子离子785.0868 [M——H]?,推断化合物34为sanguiin H1。由于sanguiin H4和sanguiin H5为顺反异构体,只能初步推断化合物17、20、30为sanguiin H4或其异构体。并且还可以推断出该水煎液含有sanguiin H1。

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  3.1.2 没食子酸多聚体类 鞣花酸为没食子酸常见的二聚体。化合物55,母离子m/z300.999 5 [M——H]?,碎片离子m/z283.994 1 [M——H——H2O]?、257.020 7 [M——H——CO2]?、229.027 3 [M——H——CO2——CO]?、201.044 3 [M——H——CO2——2CO]?,鉴定该化合物为鞣花酸[8]。以鞣花酸的裂解规律结合精确相对分子质量和文献报道[10,21,29],可以初步推断出地榆水煎液中含有没食子酰鞣花酸、二甲氧基鞣花酸及其硫酸酯、3,3′,4′-O-三甲基鞣花酸及其硫酸酯、3,3′,4′-O-三甲基鞣花酸-4-O-β-D-木糖苷、地榆酸双内酯。其相关的结构及裂解规律见图3。

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  多酚的结构复杂,并且常以大量性质相似的同系物或同分异构体的混合物形式存在。而溶质和溶剂的极性及两者间的分子作用力影响化合物在HPLC上的保留行为。分子极性和分子间作用力的来源就是偶极矩,分子偶极矩越大,极性越大[31]。因此可以通过比较分子偶极矩的大小来区分同分异构体。本研究中的酚类化合物在负离子模式下响应较好,主要为没食子酸糖苷类、鞣花酸类和儿茶素类物质。

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